北京大學生命科學學院 林忠平教授領導下的實驗室（AgMoBiol）
主要在以下領域進行工作

（1）         植物對逆境脅迫的抗性基因工程Genetic engineering for plant resistance to environmental stress

（2）         植物生物反應器生產藥用蛋白Plant bioreactor for production of pharmaceutical protein

（3）         植物次生代謝的基因調控Genetical control of secondary metabolite in plants

（4）  轉基因食品的致敏性評估Assessment of GMO allergenicity

一、提高植物對逆境脅迫的抗性

培育抗旱、抗寒的草坪草（Improvement of turfgrass resistance to drought and cold）

從厚葉旋蒴苣苔、沙蒿等幾種極端環境下生長的植物中分離耐旱、耐寒相關的基因。包括上游的轉錄因子和下游的對細胞起保護作用的基因，以及參與逆境脅迫下信號傳遞的某些基因。其中包括來自厚葉旋蒴苣苔的兩種類型脫水素基因，兩種WRKY家族的基因，屬于R2R3型的一種Myb基因，一種對缺水和髙滲起反應的藍銅蛋白基因。來自沙蒿的兩種鋅指蛋白基因。來自二月蘭的一種DREB2B家族的基因。各在研究其功能的基礎上，構建了適于在單子葉中表達的載體。通過農桿菌的介導或以基因槍法將其導入草坪草（主要是高羊茅、黑麥草、剪股穎、紫羊茅等）這些草類表現良好的抗旱性，延長綠期等。其中有的也適宜做牧草的。有的基因是依據文獻資料克隆的（專利即將過期），如海藻糖合酶基因（tps）和異戊烯基轉移酶基因（ipt）效果也很好。大量的田間試驗在進行中。有的轉基因草類已進入生產性試驗階段。我們同中國農業大學合作進行的草坪草中脫落酸代謝途徑的調控以及同中國農科院合作利用Cry8C基因做抗地下害蟲（蠐螬）的草坪草均已取得良好進展。此外，也做非轉基因的草坪草改良，包括輻射誘變技術的應用。利用這一技術培育的一種細葉髙羊毛已通過國家牧草品種的審定。

我們將上述基因用于棉花的遺傳轉化（合作單位新疆石河子大學），已取得顯著進展。主要采用適于新疆栽培的品種為受體材料，大量的轉基因的后代品系在海南擴繁，工作重點即將進入抗逆性和綜合性狀的優選。

通過遺傳修飾提高植物基某些微生物對環境的修復能力（bioremediation）亦已取得成績。例如它們更能適應污泥的環境，以及在低溫下保持較高的代謝強度。

本項目已申請相關專利 8 項（其中2項已受權）。

二、利用轉基因植物做為生物反應器產生藥用蛋白

（1）         將一種設計的人胰島素導入植物及高等真菌中表達。目標是做口服型的胰島

（2）         人表皮修復因子在植物中的表達及應用研究。

（3）  靈芝（紫芝）免疫調節蛋白基因的克隆應用研究。

以靈芝中表達胰島素為例說明如下：全球糖尿病人已經接近1.5億，其中僅我國就有近4000萬患者，且其發病率還在持續上升。世界口服胰島素市場潛力大。全球的胰島素治療劑的銷售可達30億美元。伴隨著相當大的患者人群，不能滿足患者的需要已促使一些公司開發用于胰島素釋放的供選擇的方法。靈芝具有良好的免疫調節功能，我們將重新設計的新型的人胰島素基因導入靈芝細胞，使其高效表達人胰島素。試驗證明具有良好的降血糖的功能。其技術要領如下：將人胰島素的B鏈和A鏈通過6個氨基酸的柔性連接短肽連接成一個完整的開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF），并在人胰島素原類似物基因的C端添加了內質網滯留信號（Endoplasmic Reticulum retention signal）編碼序列KDEL（Lys-Asp-Glu-Leu-COO-，即KDEL），并命名為人胰島素原類似物基因InsK。為了有利于合成的人胰島素可以正確折疊成天然的構象，在人胰島素的B鏈與A鏈之間設計了一個6個氨基酸的柔性連接短肽以代替胰島素原的C肽。因為對天然人胰島素的三維結構進行分析發現，B鏈C端和A鏈N端的空間線性距離為16.12埃，而線性排列的五肽的最小空間距離為16.0埃，為了不改變融合的多肽鏈中A鏈和B鏈的構象，推測它們之間的連接肽的最小殘基數應不少于5個殘基。考慮到B鏈C端和A鏈N端在空間上的取向相反，連接肽最好能形成β-轉角結構。不同氨基酸在形成二級結構時具有不同的傾向和能力，其中Pro和Gly很少形成α-螺旋和β-折疊，而Pro，Gly，Asn，Ser在β-轉角的構象中最常見，推測Gly-Pro-Ser的結構最有可能形成β-轉角。基于以上考慮，本實驗選用的連接肽序列為Gly-Gly-Pro-Ser-Gly-Gly Gly。在轉基因靈芝中采用了香菇三磷酸甘油醛脫氫酶（GPD）啟動子驅動人胰島素原類似物基因InsK，并構建了電擊法及PEG介導法的表達載體pbinsK和農桿菌介導的表達載體p1300-GinsK。利用這種載體將人胰島素基因送入靈芝原生質體。經過篩選獲得高效表達人胰島素的菌株。采用ELISA方法檢測，以人胰島素標準品為參照作標準曲線。實驗結果表明：人胰島素原類似物在轉基因靈芝中表達量能達到抽提總蛋白的4.40％～10.40％，每克靈芝菌絲鮮重中含有的人胰島素原類似物質量為105.0µg～174.8µg。灌喂轉基因靈芝的大鼠組血糖水平與灌喂未轉基因靈芝的對照組相比有極顯著性降低P<0.0002），除了2只血糖值下降在誤差范圍內，余下的80％大鼠血糖值均有大幅度下降，下降的最高幅度可達64％。靈芝作為生物反應器高效表達了人胰島素原類似物，每克靈芝菌絲鮮重中人胰島素原類似物的含量可以達到105.0µg～174.8µg的水平。高血糖大鼠灌喂實驗表明口服這種轉基因靈芝在4小時后可以大幅度降低大鼠的血糖水平，與對照組相比具有顯著性差異（P<0.0002）。說明此轉基因靈芝可能以口服劑型用于治療糖尿病的。（專利申請號:200610078845.8）

三、植物次生代謝的基因調控

（1）         精油代謝途徑的基因調控――從薄荷、迷迭香、熏衣草等植物中克隆了檸檬烯合酶、芳樟醇合酶基因等，并利用轉基因植物的實驗系統研究其在精油生物合成中的分子調控。

（2）  大豆異黃酮生物合成途徑的分子調控――來源于植物的、與雌激素具有相似結構，并且能夠與雌激素競爭性的結合受體，從而對人體激素的代謝和功能產生影響已成為重要的醫療保健用品。它在自然界分布狹窄，主要產生于豆科植物，在植物中對于根瘤菌與植物的共生關系的建立十分重要。通過引入大豆異黃酮合酶基因及其它一些基因的調控可以使非豆科植物某些器官產生大豆異黃酮genistein。但其產量依然較低。

（3）  白藜蘆醇生物合成途徑的分子調控――白藜蘆醇化學名為：3,5,4’-三羥基二苯乙烯，是一種重要的植物抗毒素，具有多種醫療保健作用，如具有預防心腦血管疾病、抗炎、抗癌等作用。人們在對多種植物不同部位中白藜蘆醇的含量分析后發現，葡萄皮中白藜蘆醇的含量最高，為10-100μg/g FW。可見，白藜蘆醇在自然界的含量不是很豐富，但它在制藥業、 生物制品和保健功能食品業有著巨大的市場需求。所以提高該化合物在植物中的含量或者使用基因工程手段在異源植物中大量合成白藜蘆醇引起廣泛的關注。我們從葡萄科植物川鄂爬山虎中克隆了產生白藜蘆醇的關鍵基因，芪合酶基因。將這一基因置于強啟動子的調控之下，并在閱讀框架的兩端加上MARs序列。導入煙草、生菜等植物，使這些本不產生白藜蘆醇的植物能夠產生白藜蘆醇而且產率接近葡萄皮的水平。此種生菜可以照常食用，而更富保健功能。此后我們又從爬山虎中克隆了一種稱之為C4H的基因將其導入已有外源芪合酶基因的生菜、煙草等，使其中的白藜蘆醇含量提高了數倍以上。轉基因煙草葉片中的含量可達239μg/g葉片鮮重。同時可用于提取白藜蘆醇。專利名稱：利用川鄂爬山虎STS基因培育含白藜蘆醇生菜的方法    申請號200510114。

四、轉基因食品的致敏性評估

在廣泛收集、整理過敏原基因序列和有關過敏原決定簇資料的基礎上建立了用于GMO致敏性評估的數據庫。同時在研究堅果（胡桃）、螨、草類花粉某些過敏原的基礎上建立了檢測GMO致敏性的血清學方法。此外，由于食物致敏性可能與某種蛋白質的可消化性有關。因而利用模擬的腸胃消化液進行了某些蛋白的可消化性的檢測，判定消化的時間進程和消化后的殘余片段的大小。在此基礎上建立了電腦模擬的蛋白質可消化預測的方法。

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