項目名稱：    魚類生長的內分泌學及其調控機制研究

推薦單位：    農業部

項目簡介：    本項目屬水產生物學領域。20年來，本項目對魚類生長激素（GH）分離純化、免疫測定技術、基因克隆、分泌調節機理及重組表達等進行了深入系統的研究，不僅建立了我國魚類GH和生長內分泌學的研究體系，而且形成了我國魚類生長內分泌學科，取得的主要發現和創新性成果包括：（1）分離純化草魚等多種魚類GH并制備其抗體；創建了鯉科、鮨科和鯛科等6種魚類GH酶標/放射免疫測定技術；（2）發現魚類垂體GH的分泌屬陣發式分泌型，分泌活動有明顯季節性和日周期變化規律；闡明GH分泌活動與魚體生長速率之間的關系；（3）發現魚類GH分泌活動受多種神經內分泌因子的調控，其中促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺素釋放激素（TRH）、多巴胺及其激動劑等都能刺激GH分泌，而生長抑素（SRIF）則抑制GH分泌；（4）發現IGF對GH基因表達的負反饋調控是通過激活垂體中鈣調素基因的表達而進行的；（5）發現PACAP通過PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達的機制；（6）發現去甲腎上腺素通過激活a2腎上腺素受體抑制GH分泌的信號通路；（7）發現魚類GH自分泌和旁分泌的反饋調節通路，建立了魚類GH自分泌和旁分泌反饋調節的模型；（8）發現刺激GH分泌的神經內分泌因子等通過口服途徑能顯著促進GH分泌和提高魚體生長速率，且這些因子共同使用，其促生長效果更為顯著；（9）構建了斜帶石斑魚等多種魚類cDNA文庫，克隆了GH、IGF和PACAP等生長相關功能基因10多個，研制了基因重組GH；采用投喂方法證明它能為魚消化道吸收而促進魚體生長；（10）本項目發表論文148篇，其中SCI論文51篇，SCI引用597次，其中SCI他引443次；（11）本項目申請發明專利7項，其中1項獲得授權；（12）這些成果不僅使我國魚類生長內分泌學研究達國際領先水平，極大促進了我國魚類內分泌學科的發展，而且對于世界魚類內分泌學科的發展也作出了重要貢獻，同時，這些成果對于促進水產養殖業的科技進步具有重要科學意義和應用價值。

主要發現點：  （1）發現垂體腺苷酸環化酶激活多肽(PACAP)神經纖維進入魚類生長激素(GH)細胞內的解剖學證據，闡明PACAP通過PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達的機制，首次提出了介導PACAP刺激GH分泌的信號轉導機制的模型，克隆了魚類第一個PACAP受體基因（代表性論文1、7和14; 所屬學科：水生生物生理學）；（2）發現促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺素釋放激素（TRH）、多巴胺激動劑（APO、SKF等）、PACAP、性類固醇激素（如雌二醇）等都能顯著刺激各種魚類腦垂體釋放GH（代表性論文2、4和5）；（3）發現多巴胺（Dopamine）通過激活D1型-受體刺激魚類垂體細胞釋放GH，而這種刺激作用受生長抑素和性類固醇激素的負調節；發現多巴胺是魚類性腺退化期GH釋放的主要刺激因子，而GnRH則是性腺成熟期主要的GH釋放因子；首次揭示了多巴胺刺激魚類GH分泌的信號通路（代表論文3，9）；闡明了魚類GH分泌的多因子調控機制（代表論文9; 所屬學科：水生生物生理學）；（4）首次發現魚類GH分泌為陣發式分泌，揭示草魚血清GH水平存在明顯的季節性和日周期性變化規律（代表性論文6; 所屬學科：水產生物學）；（5）發現胰島素樣生長因子（IGF）對GH基因表達的負反饋調控是通過激活鈣調素基因的表達而進行的（論文16）；（6）發現去甲腎上腺素通過激活a2腎上腺素受體抑制GH分泌的信號通路，這種抑制作用是通過抑制cAMP的生產以及其它的下游信號通路進行的，主要包括通過激活cAMP-, Ca2+-和 PKC-依賴的信號通路阻止GH分泌刺激信號的輸入（論文35; 學科：水生生物生理學）；（7）發現魚類GH和LH通過自分泌和旁分泌相互作用調節GH釋放和GH基因表達的一個新的垂體內反饋通路，建立了魚類GH自分泌和旁分泌反饋調節的模型；發現GH在垂體水平通過與JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信號通路偶聯的GH受體發揮作用，上調GH分泌和GH基因表達；GH對其分泌和合成的正向自我調節作用代表魚類生長調節的新機制（論文11、24和25; 所屬學科：水生生物生理學）；（8）發現刺激GH分泌的神經內分泌因子如GnRH類似物、多巴胺激動劑、生長抑素抑制劑等通過口服途徑能顯著促進魚類GH分泌和提高魚體生長速率，且這些因子共同使用，其促生長效果最為顯著（代表性論文8和43；所屬學科：水產生物學）；（9）發現半胱胺（CSH）在魚類起著生長抑素抑制劑的作用，能顯著刺激草魚、石斑魚腦垂體釋放GH和提高生長速率（論文26和29；所屬學科：水產生物學）；（10）構建了斜帶石斑魚等多種魚類cDNA文庫，克隆了GH、IGF和PACAP等生長相關功能基因20多個，研制了基因重組GH；采用投喂方法證明它能為魚消化道吸收而促進魚體生長（代表性論文10、27、32）；（11）創建了鯉科魚類GH單克隆抗體雜交瘤細胞系和酶聯免疫測定技術、鮨科和鯛科魚類生長激素放射免疫測定技術、鯉科和鯛科魚類生長激素酶標受體或放射受體分析法以及魚類腦垂體碎片離體孵育灌流系統等一系列技術方法（論文40、41）（所屬學科：水產生物學）。

主要完成人：  1.   林浩然

為項目負責人，對發現點2、3、5、8、9、10和11作出創造性貢獻，在該項目中的工作量占本人工作量的70%以上。 建立了魚類GH放射免疫測定技術和垂體離體孵育灌流系統; 首次證明魚類生長激素分泌特點和哺乳類相似，亦是陣發式分泌型; 發現促性腺激素釋放激素LHRH-A和sGnRH-A不僅刺激魚類GTH分泌的活性最強，而且刺激GH分泌的活性亦最強；證明TRH，多巴胺激動劑（如APO，SKF等），性類固醇激素和生長抑素抑制劑（CSH）等都能顯著刺激鯉魚腦垂體分泌GH和魚體生長; 采用投喂方法證明魚類消化道能吸收外源多肽激素和藥物并保持其生物活性; 采用基因工程技術研究GH，IGF，PACAP等基因的結構和功能，獲得基因重組產物，為基因重組產品開發利用打下基礎。

2.   陳松林

為該項目中部分課題的負責人。對發現點4、8、9、10和11作出創造性貢獻，在該項目中的工作量占本人工作量的60%以上。為國內最早開展魚類生長激素（GH）和生長內分泌研究的學者之一，建立了從同一批魚垂體中分離純化GH、催乳激素和促甲狀腺素的技術方法；分離純化出草魚GH，建立了分泌抗草魚GH單克隆抗體的雜交瘤細胞系，建立了既能測定GH生物活性、又能測定其免疫活性的酶標受體測定方法；建立了鯉科魚類GH夾心式酶標免疫測定技術（ELISA）；發現草魚種體內GH分泌存在季節性和日變化規律；闡明了外源GH在魚體內的代謝規律； 最早提出將半胱胺（CSH）作為魚類生長抑素抑制劑的研究思路；克隆了鰱生長激素基因，并在大腸桿菌中進行了表達。

3.   李文笙

對發現點1、2、8、10和11作出創造性貢獻，在項目中的工作量占本人工作量的60%以上。負責建立液相雜交/RNase 保護法檢測鯉魚GH基礎mRNA水平的年周期變化；負責完成促性腺激素釋放激素及其類似物、生長激素釋放因子和抑制因子對鯉魚腦垂體GH分泌和GH mRNA 水平影響的研究；負責完成甲狀腺激素和促甲狀腺素釋放激素對鯉魚GH分泌和GH mRNA水平影響的研究；負責完成性類固醇激素對鯉魚GH分泌和基因表達調控作用的研究；負責完成石斑魚GH基因的克隆和表達研究；參加并指導完成石斑魚GH放射免疫測定方法和ELISA方法的建立；完成石斑魚胰島素樣生長因子（IGF）Ⅰ和Ⅱ基因，腦垂體腺苷酸環化酶激活多肽（PACAP）基因等的克隆、時空表達分析等工作。

4.   黃安林

對發現點1、3、5、6、7作出創造性貢獻，在該項目中的工作量超過本人工作量的60%。首次闡明GnRH和DA D1－刺激的GH釋放的信號轉導機制; 發現PACAP神經纖維進入GH細胞內的解剖學證據，闡明PACAP通過PAC-I型受體刺激垂體GH釋放和基因表達的機制，提出了介導PACAP刺激GH分泌的信號轉導機制的模型; 用草魚作為模型，發現在GH和LH之間通過自分泌和旁分泌相互作用調節GH釋放和GH基因表達的一個新的垂體內反饋通路; 首次發現GH在垂體水平通過與JAK2/MAPK and JAK2/PI3K 信號通路偶聯的GH受體上發揮作用，上調GH分泌和GH基因表達; 首次發現促性腺激素細胞分泌的LH能夠以旁分泌的形式促進GH分泌細胞中GH轉錄子的翻譯和GH基因的轉錄。

5.   張為民

對發現點4、10和11作出創造性貢獻，在該項目中的工作量占本人工作量的40%以上。 參加實驗并證明魚類生長激素分泌活動的特點是陣發式分泌; 系統觀察與測定草魚血清生長激素，含量的晝夜變化; 參加實驗并證明草魚在饑餓一段時間后再投喂，出現明顯的補償生長; 參加草魚基因重組生長激素的分離純化實驗，為生產草魚基因生長激素提出有效的技術路線; 參加斜帶石斑魚生長激素cDNA克隆并在大腸桿菌進行融合表達; 參加黑鯛生長激素受體基因克隆及表達調節。

10篇代表性論文：  1.   Hypophysiotropic action of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the goldfish: Immunohistochemical demonstration of PACAP in the pituitary, PACAP stimulation of growth hormone

2.   Growth hormone and gonadotropin secretion in the common carp (Cyprinus carpio): In vitro interactions of gonadotropin-releasing hormone, somatostatin, and the dopamine agonist apomorphine. General and

3.   Dopamine stimulates growth hormone release from the pituitary of goldfish, Carassius auratus, through the dopamine D1 receptors. Endocrinology 130: 1201-1210

4.   The regulatory effects of thyrotropin-releasing hormone (TRH) on growth hormone secretion from perfused pituitary of common carp in vitro. Fish Physiology and Biochemistry, 11: 71-76.

5.   Effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogs and sex steriods on growth hormone (GH) secretion in common carp (Cyprinus carpio) and grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Aquaculture, 135:

6.   Espodic growth hormone secretion in the grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology, 95: 337-341.

7.   Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide as a novel hypophysiotropic factor in fish. Biochem. Cell. Biol. 78:329-343

8.   Effects of gonadotropin-releasing hormone on growth hormone secretion and gene expression in common carp pituitary. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B. 132: 335~341.

9.   Interactions of somatostatin, gonadotropin- releasing hormone, and the gonads on dopamine-stimulated growth hormone release in the goldfish. Gen Comp Endocrinol 92:366-378

10.  Development and validation of a Noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay for the growth hormone of grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Acta Zoologica Sinica 42,(2):386-393.