項目名稱：    對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）基因組和蛋白質組研究

推薦單位：    國家海洋局

項目簡介：    對蝦白斑綜合癥病毒WSSV最早出現在上世紀90年代初，是一種具有高度感染性和致死性的病毒，嚴重危害全球對蝦養殖業并造成巨大的經濟損失，僅我國自1993年爆發以來已累計損失數百億元，成為海水養殖業危害最大的病毒。WSSV的肆虐立刻引起了許多國家和地區（中國、美國、日本、臺灣地區、荷蘭、印度、韓國、新加坡等）的高度重視，但由于缺乏對病毒遺傳信息和功能特性的了解，影響了病毒的防治研究。

本項目組針對國內外在WSSV研究方面的難點，自1995年起開展了該病毒基因組分離和純化，克服了在提取過程中病毒基因組被降解和宿主DNA污染的問題，獲得了高純度完整的病毒基因組DNA，經電泳分析首次發現該病毒的基因組超過290kb，是一種尚未被人們所揭示的大病毒。在突破了該技術難點后，項目組開展了病毒結構基因組研究，率先在國際上破譯了WSSV全基因組序列，其大小為305kb，是目前發現的最大病毒之一，預測編碼基因約180個，與以往發現的病毒無任何同源性。該成果被科技部評為1999年中國基礎科學研究十大新聞，并于2000年被兩院院士評為中國十大科技進展新聞。上述發現不僅對WSSV的分子遺傳背景有了全面的了解，而且促使國際病毒分類委員會（ICTV）對WSSV分類地位的重新確認，將其單獨歸在新命名的病毒科Nimaviridae和病毒屬Whispovirus。

隨后項目組開展了WSSV功能基因和蛋白質組的研究，首次利用蛋白質質譜技術鑒定了約20多個病毒結構蛋白，并利用蛋白印跡和金標免疫電鏡術確證了其中8個病毒膜蛋白。隨后通過電泳分離結合質譜鑒定發現實際上病毒粒子由20多種膜蛋白和8種核衣殼蛋白組成，使我們對該病毒粒子的基本結構有了較為深刻的認識，有助于進一步揭示病毒粒子的感染和包裝過程，以及與宿主的相互作用，為建立特異性阻斷病毒感染的方式提供了科學依據和技術支撐。

本項目共發表國際SCI論文17 篇，其中影響因子超過3的10 篇。他引（正面引用）總次數191篇，其中單篇他引次數超過8的有8篇。

主要發現點：  1. 首次建立對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）基因組純化技術，該方法擯棄了常規純化病毒所采用的密度梯度超速離心，不僅大大縮減了純化步驟和時間，提高了病毒得率，而且在提取過程利用蛋白質抑制劑預防蝦組織蛋白酶對病毒粒子的損害，再加上DNase處理除去宿主基因組污染，使最后獲得的病毒基因組DNA純度非常高，保證了高質量病毒基因組文庫的構建。另外我們還發展了一種從感染WSSV的螯蝦組織中快速制備病毒的方法，能獲得大量高純度有感染活性的病毒粒子，有利于病毒膜蛋白的功能研究和病毒感染機理研究。所屬學科分類：水產保護學；代表性論文-1和8

2. 在國際上率先完成WSSV全基因組序列測定，基因組大小為305kb，是目前最大的病毒之一（目前發現基因組超過300kb的病毒總計7個，見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/vis.html），約有180個編碼基因，有9個可能的復制起始區。同源性檢索顯示，除了幾個與核酸代謝相關的基因有一定的同源性外，95%以上的基因或其編碼蛋白與已知的病毒基因或蛋白沒有任何同源性，另外還發現一個以往從未在病毒基因組中存在的膠原蛋白基因，說明WSSV是一個全新的病毒。 所屬學科分類：水產保護學；代表性論文-2和6

3. 在國際上最先開展WSSV的蛋白質組學分析，首次鑒定了20多個病毒結構蛋白，并利用免疫電鏡進行了病毒膜蛋白的定位驗證研究，并且糾正了病毒結構蛋白VP26最初被認為是核衣殼蛋白的錯誤觀點，同時發現該蛋白能與宿主細胞的骨架蛋白Actin有相互作用，暗示VP26在病毒粒子入核過程中起重要作用。另外抗體中和試驗發現多種病毒膜蛋白的抗體具有中和病毒感染的作用，表明這些膜蛋白可能與WSSV的感染直接相關，對進一步開展抗病毒研究有重要意義。 所屬學科分類：水產保護學；代表性論文-3, 4, 5和7

4. 國際上第一個報道了確證功能的WSSV基因，wsv214，它的編碼產物為強堿性多肽，具有DNA結合的功能，估計類似于真核生物組蛋白，起壓縮和包裝基因組DNA的作用。 所屬學科分類：水產保護學；代表性論文-9

5. 首次發現WSSV基因組上有一易變區，不同來源的病毒株在該區域發生了大片段DNA缺失現象，最大達8kb以上，包含了5個編碼基因，經感染實驗發現，片段缺失僅導致病毒的毒力減弱，并不影響其感染活性，提示病毒的缺失基因可能與病毒的毒力相關。所屬學科分類：水產保護學；代表性論文-10

主要完成人：  1.   楊豐

建立了WSSV的基因組DNA純化技術，病毒基因組DNA文庫和cDNA文庫構建，病毒全基因組DNA序列生物信息學分析，病毒基因的鑒定和功能研究。

2.   章曉波

進行WSSV的蛋白質組學及病毒膜蛋白的研究，并指導研究生進行WSSV基因功能、RNAi等研究，撰寫研究論文。

3.   徐洵

1995-2002 負責本課題的啟動，設計，研究生指導和論文撰寫。2001年以后開始啟動對蝦抗病毒分子基礎的研究。

10篇代表性論文：  1.   A simple and efficient method for purification of prawn baculovirus DNA. J. Virol. Methods, 67, 1-4

2.   Complete genome sequence of the shrimp White Spot Bacilliform Virus. J. Virol., 75 (23), 11811-20

3.   Proteomic analysis of shrimp white spot syndrome viral proteins and characterization of a novel envelope protein VP466. Mol Cell Proteomics. 1(3):223-31

4.   Transcription and identification of an envelope protein gene (p22) from shrimp white spot syndrome virus. J Gen Virol., 83: 471-7

5.   Identification of white spot syndrome virus (WSSV) envelope proteins involved in shrimp infection. Virology. 332(2):578-83.

6.   Identification of a collagen-like protein gene from white spot syndrome virus. Arch Virol., 149:215-23

7.   Interaction of white spot syndrome virus VP26 protein with actin. Virology. 336(1):93-9

8.   A simple and efficient method for purification of intact White Spot Syndrome Virus (WSSV) viral particles. Virus Res. 108, 63-7

9.   The structure and function of a gene encoding a basic peptide from prawn white spot syndrome virus. Virus Res. 79:137-44

10.  Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence. Virus Res. 2002, 90: 269-74