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項(xiàng)目名稱:    醫(yī)學(xué)分子診斷新技術(shù)的研究

推薦單位:    寧波市

項(xiàng)目簡介:    1. 科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域:本項(xiàng)目屬基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)類醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。

2. 主要內(nèi)容:(1)在國際上首次聯(lián)用免疫磁珠陽性和陰性篩選及定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),建立了外周血中微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞檢測及判斷其臨床意義的醫(yī)學(xué)分子診斷新技術(shù)。(2)以癌胚抗原(CEA)mRNA作為分子標(biāo)志,采用免疫磁珠/RT-PCR技術(shù)檢測胃癌患者外周血中的癌細(xì)胞,分析了其陽性檢出率與病期的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)早期患者也有25%的陽性率;在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)CEA mRNA的檢出率與Dukes 分期呈正相關(guān)。(3)結(jié)腸癌患者外周血細(xì)胞角蛋白20(CK20) mRNA 的檢出率與腫瘤大小、淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。(4)通過對肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白(AFP)mRNA的系統(tǒng)比較研究,發(fā)現(xiàn)這一分子標(biāo)志在肝癌鑒別診斷和血道轉(zhuǎn)移監(jiān)測方面比AFP蛋白更有優(yōu)越性。(5)應(yīng)用PCR、PCR-AFLP、PCR-RFLP、SSCP、DHPLC、DNA測序等研究技術(shù),對男性不育、表皮松解性掌跖角化癥、注意缺陷多動障礙等常染色體顯性遺傳病和多基因疾病進(jìn)行了疾病易感基因的尋找、基因突變譜的繪制、遺傳咨詢等研究工作;(6)新技術(shù)應(yīng)用于腫瘤微轉(zhuǎn)移、遺傳病的診斷中,產(chǎn)生了較大的社會效益。

3. 科學(xué)價值:先用陰性免疫磁珠去除絕大部分的白細(xì)胞,然后用陽性免疫磁珠富集腫瘤細(xì)胞,最后用特異性高的定量RT-PCR分析腫瘤細(xì)胞特異的mRNA,建立了可靠而穩(wěn)定的分析外周血微量消化系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的方法。結(jié)合了免疫磁珠與RT-PCR兩者的優(yōu)點(diǎn),使檢測的特異度和靈敏度均大大提高。優(yōu)于文獻(xiàn)報道的方法;同時克服了單獨(dú)使用RT-PCR具有一定假陽性和假陰性的缺點(diǎn)。遺傳性疾病的研究中,不少方面的成果是國際首報,對探討幾種遺傳病的分子機(jī)制、分子診斷和產(chǎn)前診斷等,都具有一定的重要理論意義和應(yīng)用價值。

4. 同行引用評價:被他人正面引用31次,其中SCI文章14篇。在4家醫(yī)療機(jī)制推廣應(yīng)用。

主要發(fā)現(xiàn)點(diǎn):  1.聯(lián)用陰性和陽性免疫磁珠及實(shí)時定量RT-PCR檢測外周血惡性腫瘤細(xì)胞方法的建立:先用CD45免疫磁珠去除絕大部分的白細(xì)胞,然后用上皮細(xì)胞特異的Ber-EP4免疫磁珠富集腫瘤細(xì)胞,最后用特異性高的實(shí)時定量RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞中的標(biāo)志mRNA,以確定血道中癌細(xì)胞的組織來源。本方法的特異度和靈敏度均高于國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的。(醫(yī)學(xué)分子生物學(xué);論文[1]、[2])

2.以癌胚抗原(CEA)mRNA作為分子標(biāo)志,發(fā)現(xiàn)胃癌、結(jié)直腸癌血道轉(zhuǎn)移是一個較普遍的早期事件。以細(xì)胞角蛋白20(CK20)mRNA作為分子標(biāo)志,發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌外周血癌細(xì)胞檢出率與腫瘤原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過對肝癌、肝硬化和肝炎患者外周血中甲胎蛋白(AFP)mRNA的系統(tǒng)比較研究,發(fā)現(xiàn)AFP mRNA檢測在肝癌鑒別診斷和血道轉(zhuǎn)移監(jiān)測方面比AFP蛋白檢測更具有優(yōu)越性。(醫(yī)學(xué)分子生物學(xué);論文[1]、[3]、[4]、[5])

3.分析了我國表皮松解性掌跖角化癥家系的KRT 9基因突變,探討了基因突變與臨床表現(xiàn)的關(guān)系,在國際上首先發(fā)現(xiàn)1種新的突變,被國際中間纖維突變數(shù)據(jù)庫收錄。通過對注意缺陷多動障礙(ADHD)患者兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因的分析,發(fā)現(xiàn)漢族兒童注意缺陷多動障礙患者的COMT基因 Val 158 Met多態(tài)性與ADHD無關(guān)聯(lián),首次提出不能以COMT基因作為一個關(guān)聯(lián)因素應(yīng)用于ADHD的臨床分子診斷。(分子遺傳學(xué);論文[6]、[7]、[8])

4.采用多重PCR的方法,對分布于AZF區(qū)與精子產(chǎn)生有關(guān)的3個區(qū)域內(nèi)的4個STS位點(diǎn):sY86(位于AZFa亞區(qū))、sY127(位于AZFb亞區(qū))、sY254 和sY255(位于AZFc亞區(qū))進(jìn)行缺失檢測,同時用RT-PCR技術(shù)檢測無精癥、少精癥患者中最易缺失的AZFc區(qū)DAZ基因在不同組織中的表達(dá)情況,并采用PCR-SSCP方法對DAZ基因內(nèi)橫跨1個外顯子和1個內(nèi)含子的sY254位點(diǎn)的點(diǎn)突變進(jìn)行分析。首次證實(shí)部分漢族無精癥患者可能與AZFc的缺失有關(guān)。對精神分裂癥的分子診斷標(biāo)記研究中,針對國內(nèi)外十分關(guān)注的精神分裂癥可能的易感基因5-HTR2A,探討了其102T/C SNP在2個漢族群體精神分裂癥群體中的分布,初步否定了關(guān)聯(lián)性。針對1個少見的常染色體顯性遺傳Stargardt黃斑營養(yǎng)不良-3樣家系,篩查了目前已知與STGD相關(guān)的3個候選基因ELOVL4、RDS和ABCR的突變信息,提示STGD3可能存在別的未知基因突變。論文發(fā)表于《Journal of Cellular and Molecular Medicine》,并被國際著名的"GeneCards"數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)列位該病研究的Top 10文獻(xiàn)。(分子遺傳學(xué);論文[9]、[10])

主要完成人:  1.   郭俊明

在本項(xiàng)目的第1、2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn),建立了血液中微量消化系腫瘤細(xì)胞的檢測方法。論文1-5、12的通訊作者,論文7、11、14的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   張咸寧

在本項(xiàng)目的第3、4發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn),建立了分子遺傳學(xué)新檢測技術(shù)及其應(yīng)用。論文6-8、10、13-17的通訊作者,論文9的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   肖丙秀

在本項(xiàng)目的第1、2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn),參與建立檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移的新技術(shù)。論文1-5、11、12的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   張新軍

在本項(xiàng)目的第2發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn),參與惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測新技術(shù)的研究和臨床應(yīng)用。論文1、4的共同作者,論文11的通訊作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的35%。

5.   樂燕萍

在本項(xiàng)目的第3、4發(fā)現(xiàn)點(diǎn)上做出了創(chuàng)造性貢獻(xiàn),參與分子遺傳新技術(shù)的研究和應(yīng)用。論文6、8的共同作者。本人在該項(xiàng)研究中的工作量占本人工作量的35%。

10篇代表性論文:  1.   Combined use of positive and negative immunomagnetic isolation followed by real-time RT-PCR for detection of the circulating tumor cells in patients with colorectal cancers/ Journal of Molecular Medic

2.   3種富集胃癌患者外周血中胃癌細(xì)胞方法的比較/世界華人消化雜志

3.   免疫磁珠與熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)在胃癌患者外周血癌細(xì)胞檢測中的應(yīng)用價值/中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志

4.   Detection of cytokeratin 20 mRNA in the peripheral blood of patients with colorectal cancer by immunomagnetic beads enrichment and real time reverse transcriptase-polymeras chain reaction/ Journal of

5.   Detecting AFP mRNA in peripheral blood of the patients with hepatocellular carcinoma, liver cirrhosis and hepatitis/Clinica Chimica Acta

6.   A novel mutation of keratin 9 gene (R162P) in a Japanese family with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

7.   An insertion-deletion mutation in keratin 9 in three Chinese families with epidermolytic palmoplantar keratoderma/ British Journal of Dermatology

8.   注意缺陷多動障礙與兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因Vall58Met多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析/中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志

9.   無精癥、少精癥患者中AZF缺失的檢測/生殖與避孕

10.  102T/C SNP in the 5-hydroxytryptamine receptor 2A (HTR2A) gene and schizophrenia in two southern Han Chinese populations: Lack of association/ American Journal of Medical Genetics Part B-Neuropsychiat

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