項目名稱：    乙肝表面抗原-抗體復合物消除免疫耐受的應用基礎研究

推薦單位：    教育部

項目簡介：    本項目屬基礎醫學領域。

幼齡感染乙肝病毒所致的免疫耐受是學者面臨的重要難題，誘生有效針對乙肝病毒的機體免疫應答是消除耐受的關鍵，但因缺乏系統的應用基礎性研究，尚未取得突破性進展。在鴨乙肝動物模型中首次發現病毒抗原-抗體復合物可消除免疫耐受的基礎上，本項目對乙肝病毒表面抗原（HBsAg）-抗體 (anti-HBs)復合物（IC）經抗原呈遞細胞（APC）作用后的機制與效應提出設想，系統研究消除免疫耐受的機理，并在臨床研究中予以驗證。

（1）用體外共孵育方法，發現IC提高了APC攝取及呈遞HBsAg的功能，特異地激活T細胞，促進產生Th1類細胞因子。在HBsAg陽性轉基因鼠中用復合物免疫，可增強特異性殺傷性T細胞的作用，增加Th1類細胞因子的分泌，誘生抗-HBs。發現復合物中抗HBs 的Fc段是介導上述作用的關鍵；用蛋白酶去除抗HBs Fc段，或換用異種動物抗體，則作用顯著降低。

（2）鑒于IC是通過外源性抗原呈遞途徑誘導特異性免疫應答，在此基礎上，創新性地設計經外源、內源性兩種途徑呈遞HBsAg的方法，將帶有編碼乙肝表面抗原基因的質粒DNA加入復合物組成IC-HBS質粒DNA三重復合物，在HBsAg陽性轉基因鼠中可降低肝細胞內HBsAg。獲我國、歐、美授權發明專利。發現質粒DNA 中CpG有利于局部誘生Th1細胞因子；機械注射在小鼠皮膚內可通過Toll-樣受體-9介導釋放細胞因子。

（3）借助APC表面標記檢測及T細胞激活試驗，在乙肝患者中證實APC與T細胞間相互作用低下。用復合物免疫正常人，可誘生高效價抗體及Th1細胞因子；用復合物免疫患者，患者的Th1類細胞因子表達升高，且血清中出現HBeAg抗體及病毒滴度下降，驗證了動物實驗所揭示的機制。本研究為有效治療乙肝患者奠定了理論基礎。

10篇主要論文被Lancet Infectious Diseases, Nature Review Microbiology，Nature Biotechnology , Hepatology 等引用101次。

主要發現點：  1．發現乙肝病毒表面抗原（HBsAg）與高親和力抗體（抗-HBs）組建的抗原-抗體免疫原性復合物 （Immuogenic complex,IC）與傳統認為引起III型變態反應的抗原-抗體免疫復合物有本質不同的作用。IC通過其中抗體Fc段的介導，經抗原呈遞細胞表面的Fc受體，將IC中的HBsAg被動地帶入抗原呈遞細胞內，使原來因免疫耐受而不能識別HBsAg的抗原呈遞細胞增強攝取HBsAg。經過加工的HBsAg呈遞給T細胞，激活的T細胞可誘生T殺傷性細胞，產生細胞因子及體液免疫應答。而引起III型變態反應的抗原-抗體復合物或因抗原-抗體比例不當，或因抗體親和力低下，在血循環中長期、大量存在,沉積在小血管內壁，引起疾病。（屬醫學微生物學科及免疫學科。代表性論文 1，2，4及中國發明專利 ZL93112409）.

2．發現在HBsAg-抗-HBs復合物中加入重組編碼S基因質粒DNA 組建-三重復合物，可更有效地消除對乙肝病毒抗原的免疫耐受。HBsAg-抗-HBs復合物是通過細胞攝入而加工、呈遞，屬外源性抗原呈遞過程；質粒S-DNA則通過細胞內表達HBsAg抗原，經內源性抗原加工呈遞過程。推測如HBsAg經外源性及內源性兩種不同途徑進行抗原呈遞，可更有效地誘生特異性免疫應答。在HBsAg陽性轉基因鼠中，用三重復合物免疫，更有效地激活T殺傷細胞，激發Th1類細胞因子，顯著降低肝內HBsAg。此外，還發現質粒DNA中的CpG核苷酸序列可在局部形成有利于TLR9陽性細胞歸巢，促進淋巴結細胞表達IL-12 mRNA，提供Th1型免疫反應的微環境。（屬醫學微生物學科，及免疫學科。代表性論文 4，7，8，9，10。獲中、美、歐洲發明專利授權，專利號分別為ZL971062919,6221664B1, 0913157）

3．發現在慢性乙肝患者中HBsAg-抗-HBs復合物有消除免疫耐受的作用。慢性乙肝患者中，抗原呈遞細胞-T細胞間相互作用功能低下。慢性乙肝患者樹突狀細胞經與復合物孵育后，CD80,CD86,CD40,HLA-II 標記表達上調，IL-12分泌水平也提高。慢性乙肝患者注射HBsAg-抗-HBs復合物后，Th1 類細胞因子升高，HBeAg轉陰，出現e抗體，血清病毒DNA降低。此外，正常人用復合物免疫后可產生高效價抗-HBs 及Th1類細胞因子。（屬醫學微生物學科、及傳染病學科。代表性論文3，5，6）

主要完成人：  1.   聞玉梅

提出免疫耐受及消除免疫耐受的設想。對本項目提出整體思路及設計，提出階段性研究課題。設計鴨乙肝，鼠、轉基因鼠以及乙肝患者的全部實驗。參加鴨乙肝動物實驗及部分小鼠實驗。參加IC的具體配比及三重復合物的實驗研究及部分動物實驗，指導研究生及研究人員進行實驗，對實驗結果分析與總結，撰寫論文(論文1-5,論文9-10)，對第一、二及三點均有創造性貢獻，在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

2.   袁正宏

1．組建了擁有自主知識產權的帶有編碼HBsAg的基因重組質粒DNA（發明專利號：ZL01105250）；

2．發現了皮膚中TLR9的表達可受應急和外傷等誘導，識別CpG后可快速產生細胞因子，部分揭示了皮膚先天免疫的機制，以此為基礎建立了物理損傷和CpG DNA作為佐劑的增強疫苗接種免疫效果的新策略。

3．參與實施了乙克治療性疫苗的部分臨床實驗，為開展臨床實驗的研究打下了

良好基礎。

論文為6-10，對第二及三點有創造性貢獻，在該項研究中的工作量占本人工作量的60%。

3.   瞿滌

負責該項目鴨乙肝病毒分離及抗原抗體血清學研究方法的建立，參加小鼠抗原-抗體-DNA的實驗及設計，乙肝患者DC細胞免疫功能的研究，論文為2,4,5,10，對第二及三點有創造性貢獻，在該項研究中的工作量占本人工作量的55%。

4.   姚忻

參加治療性乙肝疫苗抗原抗體配比實驗，參加轉基因鼠的實驗以及其他的動物實驗。乙克臨床研究病人血淋巴細胞及樹突狀細胞的功能研究實驗。具體進行流式細胞CBA實驗檢測病人各階段血清和外周血淋巴細胞特異性TH1/TH2細胞因子表達情況。論文為4，對第二及三點有創造性貢獻，在該項研究中的工作量占本人工作量的70%。

5.   何麗芳

參加該項目全過程。具體指導并參與有關組建抗原-抗體復合物的實驗研究及部分動物實驗。

參加轉基因鼠的實驗工作，參加整理與分析實驗結果。

論文為4與10，對第一及二點有創造性貢獻，在該項研究中的工作量占本人工作量的50%。

10篇代表性論文：  1.   Enhanced immunogenicity in mice with Hepatitis B vaccine complexed to human hepatitis B immunoglobulin. Chinese Medical Journal.1994:107 (10): 741-744

2.   Antigen-antibody complex as therapeutic vaccine for viral hepatitis B. Inter Rev Immunol 1999; 15:251-258.

3.   Hepatitis B vaccine and anti-HBs complex as approach for vaccine therapy. The Lancet 1995; 345: 1575-1576

4.   Therapeutic efficacy of hepatitis B surface antigen-antibodies-recombinant DNA composite HBsAg transgenic mice. Vaccine 2001: 19:4219-4225.

5.   Selective functional deficit in dendritic cell-T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepatitis 2004; 11:217-224.

6.   Toll-like receptor-9 induced by physical trauma mediates release of cytokines following exposure to CpG motif in mouse skin. Immunology. 2003:110:341-347

7.   Th2 immunity to HBsAg primed by gene gun DNA vaccination can be shifted towards Th1 immunity by co-delivery of CpG motifs-containing ODN. Scandinavian Journal of Immunology. 2003, 58:350-357.

8.   CpG motif acts as a danger signal and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination. Immunology. 2005 Jun;115(2):223-30.

9.   Vaccination with recombinant HBsAg-HBIG complex in healthy adults. Vaccine 2005; 23:2658-2664

10.  Effect of Plasmid DNA on Immunogenicity of HBsAg-Anti-HBs Complex.. Viral Immunology 1998 ; 11；65-72