項目名稱： 生物大分子光散射分析的方法與理論研究

推薦單位： 教育部

項目簡介： 在分子光譜分析法中，散射光始終是一個干擾信號。本研究利用這種干擾信號建立了光散射光譜分析方法，形成分子光譜分析的一個新分支。生物大分子（核酸、蛋白質、糖類等）的分析測定是生命科學領域的重要研究課題，光散射光譜分析法大大提高了檢測的靈敏度和選擇性。

本研究(1)發現某些有機小分子與生物大分子反應使生物大分子的光散射大大增強，并且光散射的增強程度與生物大分子的量成正比，據此建立了生物活性物質的共振光散射光譜分析法；(2)發現了用普通熒光光度計即可測定這種光散射增強信號，并建立了一系列操作簡便、靈敏度高的核酸、蛋白質等生物大分子定量分析新方法, 進一步推廣到糖類和其他生物活性物質的分析測試；(3)確定了光散射分析的定量基礎，提出了光散射強度與物質的量成線性關系的表達函數；(4)建立了界面全內反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像等系列光散射分析法, 實現了復雜樣品（如血液）的直接分析；(5)發現了發光強度與有機小分子(染料、藥物等)和生物大分子的荷電性質、靜電結合程度、所形成復合物的大小、形狀和數量等信息有關，為設計新型分子探針并研究其與生物大分子的作用機理提供理論指導。

在Anal Chem等SCI收錄刊物上發表論文112篇, 被SCI收錄的刊物上他引1821次。10篇代表性論文他引597次。其中1996和1997年發表在Anal Chem上的2篇論文的他引次數分別為201和136，在《1994-2004年十年中國的化學高引用論文》中排名第5和第14位（附件4-5-01）。日本分析化學家藤田芳一把該項工作作為研究熱點介紹給日本同行（ぶんせき<, 1999, (1) 79<）（附件4-5-02）。分析化學<家胡之德<教授等稱"黃等人首先應用光散射技術進行分析測定, 光散射光譜已逐漸成為分析化學中進行核酸和蛋白質測定的有用技術(Anal. Chim. Acta, 2001, 442, 249)"。美國著名分析化學家Marcus教授指出：方法快速、一步的簡單操作和允許大部分常見干擾如緩沖液成分存在（Anal Chem, 2003, 75, 4801）。<<

主要發現點： 1、核心發現點：

發現某些有機小分子與生物大分子反應使得生物大分子的光散射大大增強，并且光散射的增強程度與生物大分子的量成正比。為此，將分子光譜法中起干擾作用的散射光信號利用起來，建立了生物活性物質的共振光散射光譜分析法--分子光譜分析學科(代碼: 1502515)

發現了用普通熒光光度計即可測定有機小分子與生物大分子作用產生的光散射增強信號，建立了操作簡單、靈敏度高的核酸、蛋白質等生物大分子的定量分析新方法（代表論文1－5, 8）, 并進一步推廣到糖類和其他生物活性物質（如藥物）的分析測試（代表論文10）。

2、其他重要發現點

（1） 通過建立新的光路系統，改進測量方法，建立了系列光散射新分析方法--分子光譜分析學科(代碼: 1502515)

全內反射光散射分析法：引進自我設計的液-液界面全內反射系統(專利1), 將分析物萃取到液-液界面上, 提高了方法的選擇性。靈敏度比直接光散射分析方法提高1000倍(代表論文6，Anal Chem，2001)，應用于實際血清樣品中的白蛋白分析, 不需預分離。

后向光散射光譜分析法：引進角度調節裝置和鏡面反射系統(專利2), 檢測不同角度的散射光, 結合液-液界面光反射建立了后向光散射光譜分析法，靈敏度可達到pg/mL級（代表論文9，Analyst，2005）。

光散射成像分析方法：使用激光激發, 利用CCD收集單個散射粒子的發光信號, 實現了單個粒子的散射表征, 建立了基于單個散射粒子的光散射成像分析方法。檢測限達到pg/mL級, 靈敏度比普通的共振光散射分析法和熒光分析法提高1000倍（代表論文7, Anal Biochem，2003）。

（2） 確定了光散射強度與物質的量成線性關系的表達函數--分子光譜分析學科(代碼: 1502515)

確定使用熒光光度計測定的光散射信號強度可用函數I＝kcdE2( )表示,。這是光散射分析的定量基礎（代表論文2, Anal Chem，1997）。

發光強度強烈地依賴于有機小分子和生物大分子的荷電性質、靜電結合強度、所形成復合物的大小和數量。如有機小分子與蛋白質作用，信號增強可用 I = P + ( 113.9 + 1.78 × 10?3MW) c表示。式中 P包含了蛋白質的荷電性質及其與有機小分子靜電作用的強度; MW體現蛋白質分子的大小; c為濃度。

主要完成人： 李克安

共同策劃了光散射方法的實驗設計及測定方法的研究課題；進行了光散射法對染料、藥物等小分子物質與蛋白質、核酸以及糖類物質等生物大分子反應的研究，論證了這些反應使得生物大分子的光散射增強程度與生物大分子的量均服從線性關系，建立了一系列光散射測定方法（核心發現點1）。其中糖的測定對食管癌的診斷有實際意義，2005年獲河北省科技進步二等獎。

本人主持的 "生物大分子的散射光譜分析的基礎與應用研究"被國家自然科學基金委立項支持; 本人負責的"光散射技術用于生物大分子反應的基礎與分析應用的研究"獲教育部提名國家科學技術獎的自然科學一等獎（2003年）。

本人在該項研究中的工作量占本人工作量的50％。

黃承志

在北京大學攻讀博士學位期間在導師童沈陽教授和李克安教授的指導下開始光散射分析研究, 發現小分子在生物大分子表面組裝使產生光散射增強現象, 建立了光散射增強與生物活性物質的量成正比的定量模型（核心發現點1）；建立了液-液界面全內反射光散射分析法、后向光散射分析法和光散射成像分析法等系列光散射分析法（發現點2（1））。

對小分子與生物大分子反應產生光散射增強的原理以及光散射法提供散射粒子的形狀，大小和狀態等信息進行了研究，建立了理論模型（發現點2（2））。對研究生物大分子的行為提供了一種手段。

本人在該項研究中的工作量占本人工作量的80％。

趙鳳林

研究了光散射信號增強的必要條件。只有那些可以生成聚集狀態、聚合粒子非常大且具有較大的摩爾吸光系數的體系才能導致光散射信號增強；光散射強度與單個生色團的電性質、生色團間的電耦合程度以及由此形成的聚集體的大小密切相關。對于以靜電作用為主的分子識別，通常是正電荷試劑與核酸作用，這源于核酸的磷酸根帶負電荷；而負電荷試劑通常與蛋白質作用，主要是在低于蛋白質等電點的酸度下蛋白質帶正電荷。環境條件如溫度、酸度和離子強度影響它們的靜電結合能力（發現點2（2）。建立糖類物質的光散射分析法（核心發現點1）。

本人在該項研究中的工作量占本人工作量的50％。

李原芳

用光散射技術研究了蛋白質、核酸等生物大分子與具有抗菌活性的生物染料在體外的相互作用機理，指出有機小分子與生物大分子作用產生的光散射增強與生物大分子的分子量有關，并從分子構效的角度探討了有機藥物分子與蛋白質和核酸分子識別的專一性特征，對新藥的體外篩選具有指導作用（發現點2（2））。通過建立新的光路系統,改進測量方法，建立了系列光散射新分析方法（發現點2（1））。

本人在該項研究中的工作量占本人工作量的60％。

童沈陽

作為課題組負責人和研究生導師，帶領本課題組于1995年發現，當具有抗菌特性的陽離子卟啉在核酸上聚合組裝時，通過熒光分光光度計測定到卟啉共振光散射信號被微量核酸大分子大大增強，且增強的光散射信號與核酸的濃度之間存在線性關系（核心發現點1）。在本課題的思路和實驗設計上提出了指導性意見，并積極推進光散射技術的應用研究。與本課題組同志一起，為探討蛋白質、核酸等生物大分子與小分子探針的作用機理提供了一個檢測和表征的重要手段。

本人在該項研究中的工作量占本人工作量的50％。